微生物的分離純化及稀釋平板菌落計數(shù)
一、實驗原理
稀釋平板測數(shù)是根據(jù)微生物在高度稀釋條件下固體培養(yǎng)基上所形成的單個菌落是由一個單細胞繁殖而成這一培養(yǎng)特征設計的計數(shù)方法，即一個菌落代表一個單細胞。計數(shù)時，首先將待測樣品制成均勻的繁殖稀釋液，盡量使樣品中的微生物細胞分散開，使其成單個細胞存在，否則一個菌落就不只是代表一個細胞，再取一定稀釋度、一定量的稀釋液接種到平板中，使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內(nèi)。經(jīng)培養(yǎng)后，由單個細胞生長繁殖形成菌落，統(tǒng)計菌落數(shù)目，即可計算出樣品中的含菌數(shù)。此記數(shù)方法所計算的菌數(shù)是培養(yǎng)基上長出來的菌落數(shù)，故又稱活菌計數(shù)。一般用于某些產(chǎn)品檢定，如根瘤菌劑等產(chǎn)品檢定，生物制品檢驗，土壤含菌量測定及食品、水源的污染程度的檢驗。
自然條件下，微生物常以群落狀態(tài)存在，這種群落往往是不同種類微生物的混合體。為了研究某種微生物的特性或者要大量培養(yǎng)和使用某種微生物，必須從這些混雜的微生物群落中獲得純培養(yǎng)，這種獲得純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離與純化。
在自然界中，土壤是微生物生活的良好環(huán)境，其中生活的微生物數(shù)量和種類都是極其豐富的，因此土壤是人類開發(fā)利用微生物資源的重要基地。土壤中的微生物數(shù)量、種類與土壤肥力有關，肥沃的土壤中多，貧瘠土壤中少。其生理類群則與土壤的其它理化性質(zhì)，如通氣、pH有關，例如在通氣良好的菜園土中，好氣性微生物占有**優(yōu)勢。本實驗以菜園土為材料分離土壤中的好氣性細菌，并進行數(shù)量測定。
分離微生物時，一般是根據(jù)該微生物對營養(yǎng)、pH、氧氣等要求的不同，供給它們適宜的生活條件，或加入某種抑制劑造成只利于該菌種生長，不利于其它菌種生長的環(huán)境，從而淘汰不需要的菌種。分離微生物常用的方法有稀釋平板分離法和劃線分離法，根據(jù)不同的材料，可以采用不同方法，其*終目的是要在培養(yǎng)基上出現(xiàn)欲分離微生物的單個菌落，必要時再對單個菌落進一步分離純化。在用稀釋平板分離微生物時，還可以同時測定待分離的微生物的數(shù)量。
放線菌與細菌同屬原核微生物，是重要的***產(chǎn)生菌，在土壤中的數(shù)量僅次于細菌，尤其是在有機質(zhì)豐富、透氣性好的中性到微堿性土壤中的數(shù)量較多。本實驗采用高氏一號瓊脂培養(yǎng)基分離和計數(shù)菜園土中的放線菌。
**在土壤中的數(shù)量次于細菌和放線菌，主要在有機質(zhì)豐富、透氣性好的偏酸性土壤中較多。分離土壤中的**并不難，但由于其菌落大，容易擴展，計數(shù)準確性較低。本實驗采用加有氯霉素或慶大霉素和孟加拉紅的馬丁氏培養(yǎng)基分離及計數(shù)菜園土中的**。按一般資料介紹為鏈霉素，但此種***要先配成一定濃度的溶液，且應于倒平板前才加入培養(yǎng)基中。在此培養(yǎng)基上，放線菌和細菌被氯霉素或慶大霉素和孟加拉紅所抑制，但大多數(shù)**能夠生存，且其菌落受孟加拉紅的抑制而較小，從而避免了某些**的擴散蔓延而帶來的數(shù)量上的誤差。
二、實驗材料
1、活材料：蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）菌劑。
2、培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基；高氏一號瓊脂培養(yǎng)基；加有氯霉素（或慶大霉素）和孟加拉紅的馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基:在1000mL培養(yǎng)基中加入注射用氯霉素2mL，孟加拉紅33.4mg，均于**前加入。
3、材料：肥沃茶園土。
實驗用品
內(nèi)裝15～20個玻璃珠的90mL無菌水、9mL無菌水、直徑9cm的無菌平皿、1mL無菌吸管、天平、稱樣瓶、記號筆、玻璃刮鏟、經(jīng)2mm土壤篩過篩的菜園、天平、試管架、無菌稱量紙、酒精燈、火柴、接種環(huán)、無菌水。
三、實驗方法
（一）稀釋平板測數(shù)法
1、樣品稀釋液的制備
準確稱取待測樣品10g，放入裝有90mL無菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，用手或置搖床上振蕩20min，使微生物細胞分散，靜置20～30s，即成10－1稀釋液；再用1mL無菌吸管，吸取10－1稀釋液1mL，移入裝有9mL無菌水的試管中，吹吸3次，讓菌液混合均勻，即成10－2稀釋液；再換一支無菌吸管，吸取10－2稀釋液1mL，移入裝有9mL無菌水的試管中，也吹吸3次，即成10－3稀釋液；以此類推，連續(xù)稀釋，制成10－4、10－5、10－6、10－7、10－8、10－9等一系列稀釋菌液。
用稀釋平板計數(shù)時，待測菌稀釋度的選擇應根據(jù)樣品確定。樣品中所含待測菌的數(shù)量多時，稀釋度應高，反之則低。通常測定細菌菌劑含菌數(shù)時，采用10－7、10－8、10－9稀釋度，測定土壤細菌數(shù)量時，采用10－4、10－5、10－6稀釋度，測定放線菌數(shù)量時，采用10－3、10－4、10－5稀釋度，測定**數(shù)量時，采用10－2、10－3、10－4稀釋度。
2、平板接種培養(yǎng)
平板接種培養(yǎng)有混合平板培養(yǎng)法和涂抹平板培養(yǎng)法兩種方法。
⑴混合平板培養(yǎng)法
將無菌平板編上10－7、10－8、10－9號碼，每一號碼設置三個重復，用無菌吸管按無菌操作要求吸取1×10－9稀釋液各1mL放入編號10－9的3個平板中，同法吸取10－8稀釋液各1mL放入編號1×10－8的3個平板中，再吸取1×10－7稀釋液各1mL放入編號1×10－7的3個平板中，由低濃度向高濃度時，吸管可不必更換。然后在9個平板中分別倒入已熔化并冷卻至45～50℃的細菌培養(yǎng)基，輕輕轉動平板，使菌液與培養(yǎng)基混合均勻，冷凝后倒置，在30℃下培養(yǎng)。至菌落長出后即可計數(shù)。
⑵涂抹平板計數(shù)法
涂抹平板計數(shù)法與混合法基本相同，所不同的是先將培養(yǎng)基熔化后趁熱倒入無菌平板中，待凝固后編號，然后用無菌吸管吸取0.1mL菌液對號接種在不同稀釋度編號的瓊脂平板上，每個編號設三個重復。再用無菌刮鏟將菌液在平板上涂抹均勻，每個稀釋度用一個**刮鏟，更換稀釋度時需將刮鏟灼燒**。在由低濃度向高濃度涂抹時，也可以不更換刮鏟。將涂抹好的平板平放于桌上20～30min，使菌液滲透入培養(yǎng)基內(nèi)，然后將平板倒轉，保溫培養(yǎng)，至菌落長出后即可計數(shù)。
（二）土壤中好氣性細菌的分離與計數(shù)
1、土壤稀釋液的制備
按“稀釋平板測數(shù)法”的相同步驟進行，按無菌操作法將土壤稀釋至10－6即可。
2、分離方法
可以用三種方法進行分離。
⑴混菌法：按“稀釋平板測數(shù)法”中的“混合平板培養(yǎng)法”進行，使用的稀釋度為10－4、10－4、10－6三個，各做3個重復。
⑵涂抹法：按“稀釋平板測數(shù)法”中的“涂抹平板測數(shù)法”進行，使用的稀釋度為10－3、10－4、10－5三個，各做3個重復。
以上兩法又統(tǒng)稱為稀釋平板分離法，可同時用于所分離菌的計數(shù)。
⑶劃線法：用**接種環(huán)沾取10-1稀釋液1環(huán)于已凝固的平板上進行劃線（圖示）。劃線可按以下兩種方式進行，一種為交叉劃線法，是在平板的一邊做**次“Z”字形劃線。轉動培養(yǎng)皿70°角，將接種環(huán)在火上燒過并冷卻后，通過**次劃線部分，做**次“Z”字形劃線。同法進行第三次、第四次劃線。另一種為邊疆劃線法，是從平板邊緣的一點開始，連續(xù)作緊密的波浪式劃線，直至平板中央。轉動培養(yǎng)皿180°，再從平板另一邊（不燒接種環(huán)）同樣劃線至平板中央。劃線法實質(zhì)上屬于一種“由點到線”的稀釋法，較適用于含菌比較單一的材料的純化，對于土壤這類微生物高度混雜的樣品則較少使用。
以上各種分離法，都應按無菌操作進行。所用的培養(yǎng)基若在倒平板前，按50μg/m L 的量加入用乙醇溶解的制霉菌素或放線菌酮（起抑制霉菌的作用），效果會更好。
3、培養(yǎng)
將上述接種過土壤懸液的平板倒置，于28～30℃培養(yǎng)，至長出菌落為止（24～36h）。
4、挑菌純化
在平板上選擇分離較好的有代表性的單菌落接種斜面，同時作涂片檢查，若發(fā)現(xiàn)不純，應挑取此菌落做進一步劃線分離，或制成菌懸液再做稀釋分離，直至獲得純培養(yǎng)體。
5、計數(shù)
選取混菌法和涂抹法中每皿菌落數(shù)30～300的平板，分別按“稀釋平板測數(shù)法”中的“混合平板測數(shù)法”和“涂抹平板測數(shù)法”中的公式計數(shù)。這樣求得的是每克原始土樣中的活菌數(shù)，若要折算為每克干土的含菌數(shù)，還應將此數(shù)值除以干土在土樣中所占的質(zhì)量分數(shù)(烘干土的質(zhì)量/原土樣的質(zhì)量)。
注：土壤含水量的測定是將一定質(zhì)量的土壤在105～110℃下烘干至恒重，再稱干重。
（三）、土壤中放線菌的分離與計數(shù)
1、土壤稀釋液的制備
按實驗“稀釋平板計數(shù)法”中的方法進行，將菜園土稀釋至10－5。在稀釋時，可在盛無菌水的三角瓶中加10滴100g/L的石炭酸溶液和50μg/m L 的制霉菌素以抑制細菌和霉菌的生長。
2、分離方法
采用稀釋平板分離法，又可分為兩種方法。
⑴混菌法：按“稀釋平板計數(shù)法”中的“混合平板培養(yǎng)法”進行，所不同者是稀釋度，應采用10－3、10－4、10－5三個稀釋度，各做3個重復。
⑵涂抹法：按“稀釋平板計數(shù)法”中的“涂抹平板計數(shù)法”進行，應采用10－2、10－3、10－4三個稀釋度，各做3個重復。
3、培養(yǎng)
將上述接種過土壤懸液的平板倒置于28～30℃培養(yǎng)4～5d。
4、挑菌純化
從平板中選擇分離較好的放線菌菌落（應與細菌菌落區(qū)別開）較接斜面，并制片作純度檢查，若不純，應進一步將該菌作稀釋平板分離或劃線分離，直至獲得純培養(yǎng)。
（四）、土壤中**的分離純化與計數(shù)
1、土壤稀釋液的制備
按實驗“稀釋平板計數(shù)法”中的方法進行，將土樣稀釋至10－4。
2、分離方法
采用稀釋平板分離法。又可分為兩種方法。
⑴混菌法：按“稀釋平板計數(shù)法”中的“混合平板培養(yǎng)法”進行，所不同的是稀釋度，應選10-2、10－3、10－4三個稀釋度進行接種。
⑵涂抹法：按“稀釋平板計數(shù)法”中的“涂抹平板計數(shù)法”進行，所不同的是稀釋度，應選10-1、10－2、10－3三個稀釋度進行接種。
3、培養(yǎng)
將上述接種土壤懸液的平板倒置于28℃培養(yǎng)3～5d。
4、挑菌純化
從長有單菌落的平板中選取典型的**菌落（包括酵母菌菌落）轉接斜面，并同時制片作純度檢查。若不純，應進一步挑取該菌落采用劃線分離，或制成菌懸液進一步作稀釋分離，直至獲得純培養(yǎng)體為止。
5、計數(shù)
選取每皿菌落數(shù)在10～100之間的平板用于計數(shù)。不應遺漏酵母菌的菌落，必要時可制片檢查，以免誤為細菌菌落，具體方法見土壤中好氣性細菌的分離與計數(shù)。
6、菌種保存
將分離到的**轉接到PDA斜面上培養(yǎng)，待長好后，置于冰籍中保存，必要時進行深入研究。