本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T 4789.38-2008 《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸桿菌計數(shù)》。
本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T 4789.38-2008相比，主要變化如下：
——修改了標(biāo)準(zhǔn)的中文名稱；
——修改了培養(yǎng)基和試劑；
——將“**法大腸桿菌VRB-MUG平板計數(shù)法”改為“大腸埃希氏菌平板計數(shù)法（**法）”；
——刪除了“第三法大腸桿菌PetrifilmTM測試片計數(shù)法”；
——修改了附錄A。
食品**國家標(biāo)準(zhǔn)
《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸埃希氏菌計數(shù)》
1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中大腸埃希氏菌（Escherichia coli）計數(shù)的方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中大腸埃希氏菌的計數(shù)，其中大腸埃希氏菌平板計數(shù)法（**法）不適用于貝類產(chǎn)品。
2 術(shù)語和定義
2.1 大腸埃希氏菌 Escherichia coli
大腸桿菌 廣泛存在于人和溫血動物的腸道中，能夠在44.5℃發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，IMViC（靛基質(zhì)、甲基紅、VP試驗(yàn)、檸檬酸鹽）生化試驗(yàn)為＋＋－－或－＋－－的革蘭氏陰性桿菌。以此作為糞便污染指標(biāo)來評價食品的衛(wèi)生狀況，推斷食品中腸道致病菌污染的可能性。
2.2 *可能數(shù)
基于泊松分布的一種間接計數(shù)方法，簡稱為MPN。
3 設(shè)備和材料
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)**及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：
a）恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃；
b）冰箱：2℃～5℃；
c）恒溫水浴箱：44.5℃±0.2℃；
d）天平：感量為0.1g；
c）均質(zhì)器；
d）振蕩器；
e）無菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸頭；
f）無菌錐形瓶：容量500 mL；
g）無菌培養(yǎng)皿：直徑90 mm；
h）pH計或pH比色管或精密pH試紙；
i）菌落計數(shù)器；
j）紫外燈：波長360nm～366nm，功率≤6 W。
4 培養(yǎng)基和試劑
4.1月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯：見附錄A中A.1。
4.2EC肉湯（E.coli broth）：見附錄A中A.2。
4.3蛋白胨水：見附錄A中A.3。
4.4緩沖葡萄糖蛋白胨水[甲基紅(MR)和V-P試驗(yàn)用]：見附錄A中A.4。
4.5 西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基：見附錄A中A.5。
4.6 磷酸鹽緩沖液：見附錄A中A.6。
4.7 伊紅美藍(lán)（EMB）瓊脂：見附錄A中A.7。
4.8 營養(yǎng)瓊脂斜面：見附錄A中A.8。
4.9 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）：見附錄A中A.9。
4.10 結(jié)晶紫中性紅膽鹽-4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷瓊脂（VRBA-MUG）：見附錄A中A.10。
4.11 革蘭氏染色液：見附錄A中A.11。
4.12 Kovacs靛基質(zhì)試劑：見附錄A中A.12。
4.13無菌1mol/L NaOH：見附錄A中A.13。
4.14無菌1mol/L HCl：見附錄A中A.14。
5 大腸埃希氏菌MPN計數(shù)（**法）
5.1 檢驗(yàn)程序
大腸埃希氏菌MPN計數(shù)的檢驗(yàn)程序見圖1。
5.2 操作步驟
5.2.1 樣品的稀釋
5.2.1.1 固體和半固體樣品：稱取25g樣品，放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8 000 r/min～10 000 r/min均質(zhì)1 min～2 min，制成1:10樣品勻液，或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min～2 min制成1:10的樣品勻液。
5.2.1.2 液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。
5.2.1.3 樣品勻液的pH值應(yīng)在6.5～7.5之間，必要時分別用1 mol/LNaOH或1 mol/L HCl調(diào)節(jié)。
5.2.1.4 用1 mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液的無菌試管中（注意吸管或吸頭**不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1 mL無菌吸管或吸頭反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。
5.2.1.5 根據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成10倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1 mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15 min。
5.2.2 初發(fā)酵試驗(yàn)
每個樣品，選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1 mL（如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯），36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，觀察小倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，24h±2h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)48h±2h。產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。如所有LST肉湯管均未產(chǎn)氣，即可報告大腸埃希氏菌MPN結(jié)果。
5.2.3 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)
用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于已提前預(yù)溫至45℃的EC肉湯管中，放入帶蓋的44.5℃±0.2℃水浴箱內(nèi)。水浴的水面應(yīng)高于肉湯培養(yǎng)基液面，培養(yǎng)24h±2h，檢查小倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，如未有產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h。記錄在24h和48h內(nèi)產(chǎn)氣的EC肉湯管數(shù)。如所有EC肉湯管均未產(chǎn)氣，即可報告大腸埃希氏菌MPN結(jié)果；如有產(chǎn)氣者，則進(jìn)行EMB平板分離培養(yǎng)。
5.2.4 伊紅美藍(lán)平板分離培養(yǎng)
輕輕振搖各產(chǎn)氣管，用接種環(huán)取培養(yǎng)物分別劃線接種于EMB平板，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。觀察平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。
5.2.5 營養(yǎng)瓊脂斜面或平板培養(yǎng)
從每個平板上挑5個典型菌落，如無典型菌落則挑取可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位，移種到營養(yǎng)瓊脂斜面或平板上，36℃±1℃，培養(yǎng)18h～24h。取培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色和生化試驗(yàn)。
5.2.6 鑒定
取培養(yǎng)物進(jìn)行靛基質(zhì)試驗(yàn)、MR-VP試驗(yàn)和檸檬酸鹽利用試驗(yàn)。大腸埃希氏菌與非大腸埃希氏菌的生化鑒別見表1。
5.3 大腸埃希氏菌MPN 計數(shù)的報告
大腸埃希氏菌為革蘭氏陰性無芽胞桿菌，發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，IMViC生化試驗(yàn)為＋＋――或－＋－－。只要有1個菌落鑒定為大腸埃希氏菌，其所代表的LST肉湯管即為大腸埃希氏菌陽性。依據(jù)LST肉湯陽性管數(shù)查MPN表（見附錄B），報告每g（mL）樣品中大腸埃希氏菌MPN值。
6 大腸埃希氏菌平板計數(shù)法（**法）
6.1 檢驗(yàn)程序
大腸埃希氏菌平板計數(shù)法的檢驗(yàn)程序見圖2。
6.2操作步驟
6.2.1 樣品的稀釋
按5.2.1進(jìn)行。
6.2.2 平板計數(shù)
6.2.2.1 選取2個～3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度接種2個無菌平皿，每皿1 mL。同時取1 mL稀釋液加入無菌平皿做空白對照。
6.2.2.2 將10mL～15mL冷至45℃±0.5℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）傾注于每個平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣品勻液充分混勻。待瓊脂凝固后，再加3 mL～4 mLVRBA-MUG覆蓋平板表層。凝固后翻轉(zhuǎn)平板，36℃±1℃培養(yǎng)18 h～24 h。
6.3 平板菌落數(shù)的選擇
選擇菌落數(shù)在10CFU～100CFU之間的平板，暗室中360 nm～366 nm 波長紫外燈照射下，計數(shù)平板上發(fā)淺藍(lán)色熒光的菌落。
檢驗(yàn)時用已知MUG陽性菌株（如大腸埃希氏菌ATCC 25922）和產(chǎn)氣腸桿菌（如ATCC 13048）做陽性和陰性對照。
6.4 大腸埃希氏菌平板計數(shù)的報告
兩個平板上發(fā)熒光菌落數(shù)的平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，報告每g（mL）樣品中大腸埃希氏菌數(shù)，以CFU/g (mL)表示。若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小于1乘以*低稀釋倍數(shù)報告。